一、这项工作的意义及一些基本概念

• Reads数

  

• 测序深度

  • 测序深度（Sequencing Depth）是指：测序得到的碱基总量（bp）与基因组（转录组或测序目标区域大小）的比值，是评价测序量的指标之一。 工欲善其事，必先利其器 先来了解一下测序深度

• Kilobase：千碱基

二、三种方法原理

2.1 RPKM (Reads Per Kilobase Million)

適用於单端测序文库

1. 第一步先將测序深度標准化，计算方法很简单，【样品该基因的数该样品所有基因数的和】先分別计算出每个样本的总reads数（这里以10为单位），然后將表中数据分別除以总reads数即可，这样就得到了reads per million.【$\frac{样品该基因的reads数}{该样品所有基因reads数的和}$】
2. 第二步即是基因长度的標准化了。將表2的read per million直接除以基因长度即可【$\frac{样品该基因的\ reads\ per \ million}{该数对应的行值}$】

2.2 FPKM (Fragments Per Kilobase Million)

FPKM和RPKM的定义是相同的，但適用於双端测序文库

FPKM会將配对比对到一个片段（fragment）上的两个reads计算一次，接下来的计算过程跟RPKM一样。

2.3 TPM (Transcripts Per Million)

同样是標准化测序深度和基因长度，TPM的不同在於它的处理顺序是不同的。即先考虑基因长度，再是测序深度。

1. 第一步直接除以基因长度，得到reads per kilobase【$\frac{样品该基因的reads数}{该数对应的行值}$】

2. 第二步標准化测序深度时，总的reads数要用第一步中除过基因长度的数值。【$\frac{样品该基因的\ reads\ per\ kilobase}{该样品所有基因\ reads\ per\ kilobase的和}$】

三、TPM更有优势的原因

下面，是考验你们数学功底的时候了，有没有看出来TPM分分钟完虐FPKM/RPKM？其实，只要我们在表3和表5下面多加一行你就能很轻鬆地看到区別了。

我们看到每个样本的TPM的总和是相同的，这就意味着 TPM数值能体现出比对上某个基因的reads的比例，使得该数值可以直接进行样本间的比较。

四、关键计算步骤

Kilobase：$10^3$

Million：$10^6$

综合数量级：$10^9$【不这样处理的话，RPKM/FPKM的值会非常小，不方便后续的处理和可视化，处理后的意义也相应变成per kilobase million】

五、相关参考资料及拓展阅读

1. RPKM, FPKM, TPM区别
2. 生物信息学100个基础问题 —— 第36题 RNA-Seq 数据的定量基本假设以及TPM
3. FPKM——百度百科
4. reads数，测序深度笔记
5. 标准化方法比较